ayuss11s's blog


LAPORAN SFS PREPARASI HOMOGENAT DAN ISOLASI FRAKSI INTI SEL HATI TIKUS
Thursday May 16th 2013, 6:05 am
Filed under: Uncategorized

Laporan Praktikum Hari/Tanggal: Senin/ 18 Maret 2013
Struktur Fungsi Subseluler Waktu : 08.00-11.00 WIB
PJP : Syaefuddin, MSi
Asisten : Edwin Afitriansyah
Mina Ervani SL
Tuhfah Amaliah
Nurul Syifa

PREPARASI HOMOGENAT DAN ISOLASI FRAKSI INTI
SEL HATI TIKUS

Kelompok 02

Ayu Syafitri S G84110002
Rani Nur Fitriani G84110001
Yuyun Hikmatul Uyun G84110088

DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
Pendahuluan
Fraksinasi merupakan suatu proses pemisahan kuantitas tertentu dari campuran yang dapat dibagi dalam beberapa jumlah kecil (fraksi) komposisi perubahan berdasarkan kelandaian (Hendra 1989). Menurut Campbell (2000) fraksinasi subseluler adalah suatu metode pemisahan sel dalam beberapa fraksi menjadi organel-organel seluler. Pemisahan ini berdasarkan bobot jenis dari tiap fraksi. Metode yang digunakan adalah sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan suatu metode yang digunakan dalam pencapaian sedimentasi dimana partikel-partikel yang ada dalam suatu bahan dipisahkan dari campurannya (Boyer 2000). Prinsip yang digunakan yaitu objek yang diputar secara horizontal pada jarak radial dari titik yang dikenakan gaya sentrifugal.
Sentrifugasi terbagi menjadi dua macam berdasarkan prinsip penggunaannya, yaitu berdasarkan massa, ukuran atau panjang partikel berdasarkan densitasnya. Sentrifugasi bergantung pada kekuatan sedimentasi atau pengendapan partikel dengan memanfaatkan massa, ukuran dan densitas partikel. Semakin cepat partikel mengendap maka semakin efektif proses sentrifugasi. Kecepatan sedimentasi atau pengendapan ini ditentukan oleh beberapa hal yaitu berat molekul dan berat partikel. Semakin tinggi bobot molekulnya maka semakin tinggi pula kecepatanya. Berat partikel akan mempengaruhi gerakan partikel ketika disentrifugasi (Yuwono 2008).
Dalam percobaan ini, digunakan tikus jenis Sprague Dawley sebagai hewan percobaan. Hewan laboratorium atau hewan percobaan adalah hewan yang sengaja dipelihara dan diternakkan untuk dipakai sebagai hewan model guna mempelajari dan mengembangkan berbagai macam bidang ilmu dalam skala penelitian atau pangamatan laboratorik. Tikus termasuk hewan mamalia, oleh sebab itu dampaknya terhadap suatu perlakuan mungkin tidak jauh berbeda dibanding dengan mamalia lainnya. Tikus merupakan hewan laboratorium yang banyak digunakan dalam penelitian dan percobaan antara lain untuk mempelajari pengaruh obat-obatan, toksisitas, metabolisme, embriologi maupun dalam mempelajari tingkah laku.
Dalam penelitian, terdapat beberapa galur tikus yang sering digunakan. Galur-galur tersebut antara lain: Wistar, Sprague-Dawley, dan Long Evans (Kohn&Bartold 1984). Wistar adalah tikus strain outbred tikus albino milik spesies Rattus norvegicus. Tikus ini lebih aktif dari pada jenis lain seperti tikus Sprague Dawley. Galur Sprague Dawley merupakan jenis outbred tikus albino serbaguna digunakan secara ekstensif dalam riset medis. Keuntungan utamanya adalah ketenangan dan kemudahan penanganannya. Long Evants berasal dari penyilangkan beberapa Wistar betina dengan jantan abu-abu liar. Mereka dimanfaatkan sebagai model serbaguna organisme, sering dalam perilaku dan penelitian obesitas.

Tujuan Percobaan
Praktikum ini bertujuan memahami prinsip fraksianasi, memperoleh homogenat sel hati tikus, mengisolasi fraksi inti sel dari homogenat tikus yang diperoleh.

Alat dan Bahan
Alat yang digunakan pada preparasi homogenat sel hati tikus, yaitu: scalpel dan blade, gunting, pinset, gelas piala, neraca analitik, alat penggerus jaringan (homogenizer), tabung plastik kecil (vial), label, tabung sentrifus, dan mesin sentrifus. Bahan yang digunakan yaitu: larutan sukrosa 0.25 mM–EDTA 1 mM dingin, kertas tisu, dan tikus jantan dari jenis Sprague Dawley.
Alat yang digunakan pada isolasasi fraksi inti, yaitu: gelas piala, kain blacu, label, corong, tabung, dan mesin sentrifus. Bahan yang digunakan yaitu: pellet fraksi inti, kain blacu, dan sukrosa 0.25 M – CaCl2 3 mM.

Prosedur Percobaan
Pada percobaan preparasi homogenat sel hati tikus, tikus jantan dari jenis Sprague Dawley diperlakukan secara halus lalu dibius dengan eter. Tikus kemudian dibaringkan untuk dibedah bagian perutnya dengan menggunakan gunting. Setelah organ hati tikus diperoleh, hati diambil dan langsung dimasukkan larutan EDTA dingin. Selanjutnya, hati dilap dengan kertas tisu agar bersih dari darah. Kemudian hati ditimbang. Hati dipotong-potong sambil dibilas dengan larutan EDTA. Ulangi hingga hati bersih dari darah. Hati dihaluskan dengan homogenizer dengan ditambahkan larutan sukrosa EDTA. Hasil homogenisasi dimasukkan dalam vial diberi label “homogenat”. Sisa homogenat sebanyak 20 mL ditambah 20 mL larutan sukrosa EDTA lalu dimasukkan ke dalam tabung sentrifus. Campuran disentrifugasi pada 700 g selama 10 menit. Setelah 10 menit, diperoleh hasil berupa supernatan dan pellet. Pellet disimpan untuk isolasi fraksi inti.
Pada percobaan isolasi fraksi inti, pellet hasil preparasi homogenat sel hati tikus ditambah 10 mL sukrosa 0.25 M – Cacl2 3 mM. kemudian disaring dengan kain blacu 2 lapis yang diletakkan pada corong. Partikel seluler dicuci dengan 10 mL sukrosa 0.25 M – Cacl2 3 mM . filtrat disentrifugasi dengan kecepatan 1500 g selam 10 menit. Diperoleh hasil berupa supernatan dan pelet. Supernatan dibuang. Pelet diresuspensi dengan 10 mL larutan sukrosa 0.25 M – Cacl2 3 mM. kemudian suspensi dibagi empat bagian dan dimasukkan ke dalam vial, tapi pada percobaan hanya dua vialyang dgunakan. Kemudian suspense diberi label “fraksi inti”.

Hasil Percobaan
Tabel 1 Fraksi inti sel hati tikus
Sampel Bobot Hati Awal (g) Bobot Pelet Homogenat (g) Bobot Pelet Fraksi Inti (g) % Rendemen
1 5.50 3.16 1.37 24.91
2 5.03 - 2.07 41.15
3 4.09 2.28 1.13 27.63
4
5
6
7 4.24
5.01
5.07
5.09 -
-
-
- 2.98
1.57
1.51
2.24 70.28
31.40
29.78
44.01
Keterangan: bobot pelet homogenat sampel 2, 4, 5, 6, dan 7 tidak ditimbang.
Contoh perhitungan (Data sampel 1)
RPM untuk preparasi homogenat RPM untuk isolasi inti
RCF = 1.12 x 108 x (RPM/1000)^2 RCF = 1.12 x 108 x (RPM/1000)^2
RPM = √((RCF x 〖1000〗^2)/(1.12 x 108)) RPM = √((RCF x 〖1000〗^2)/(1.12 x 108))
RPM = √((700 x 〖1000〗^2)/(1.12 x 108)) RPM = √((1500 x 〖1000〗^2)/(1.12 x 108))
RPM = 2,405.6261 RPM = 3,521.4761

Bobot pelet homogenat = (m pelet homogenat + tabung) – m kosong tabung
= 19.55 g – 16.39 g
= 3.16 g

Bobot pelet fraksi inti = (m pelet fraksi inti + tabung) – m kosong tabung
= 17.11 g – 15.74 g
= 1.37 g

% Rendemen = (Bobot pelet fraksi inti)/(Bobot hati awal) x 100%
= (1.37 g)/(5.50 g) x 100%
= 24.91%

Pembahasan
Berbagai metode isolasi untuk meneliti kompartemen sel telah dikembangkan. Isolasi dari komponen sel dimulai dengan memotong-motong jaringan yang akan diperiksa sekecil mungkin, disusul homogenisasi (ekstraksi sel). Percobaan yang dilakukan ialah membuat homogenat dari sel hati tikus dan melakukan isolasi terhadap inti sel. metode pemisahan sel dalam beberapa fraksi menjadi organel-organel seluler disebut fraksinasi subseluler (Campbell 2000). Pemisahan ini berdasarkan bobot jenis dari tiap fraksi. Metode yang digunakan adalah sentrifugasi yang merupakan dalam pencapian sedimentasi dimana partikel-partikel yang ada dalam suatu bahan dipisahkan dari campurannya (Boyer 2000).
Fraksionasi sel ini dapat digunakan untuk mempersiapkan komponen-komponen spesifik sel dalam jumlah besar untuk mengkaji komposisi dan fungsinya. (Campbell 2000) Komponen spesifik yang ada pada percobaan ini ialah inti sel. Organel ini merupakan perpustakaan genetik yang dimiliki oleh sel eukariot. Hal itu dikarenakan inti sel memiliki struktur DNA yang mengontrol sistem kerja pada sel tersebut. Inti sel yang akan diisolasi berasal dari hati tikus jantan galur Sprague Dawley. Hati ialah organ yang sangat penting dalam kehidupan. Hati terbagi dalam dua lobus, yaitu kanan dan kiri. Organ ini berperan dalam proses sekresi, metabolism, penyimpanan detoksifikasi, produksi panas, dan penyimpanan darah (Sloane 2003).
Pada proses sentrifugasi, partikel-partikel yang berat jenisnya lebih berat daripada sekelilingnya akan mengendap (sedimentasi). Sebaliknya bila berat jenisnya lebih kecil akan mengapung. Makin besar perbedaan berat jenis, makin cepat partikel bermigrasi. Bila tidak ada berat jenis (isopiknik), maka partikel akan melayang. (Koolman 1994). Organ hati digunakan sebagai sampel karena memiliki metabolism yang baik (Sloane 2003).
Hewan percobaan yang digunakan ialah tikus jantan galur Sprague Dawley. Galur ini dipilih karena memiliki kelebihan yaitu kemudahan dalam penanganannya karena tikus ini tidak begitu aktif. Hewan yang digunakan dalam percobaan ini adalah tikus yang berkelamin jantan. Tikus berkelamin jantan digunakan karena kandungan hatinya lebih banyak daripada tikus betina dan pada tikus betina memiliki siklus hormonal sehingga akan mempengaruhi percobaan bila digunakan tikus betina.
Percobaan ini menggunakan bahan-bahan kimia, diantaranya eter, sukrosa EDTA, dan sukrosa CaCl2. Eter berfungsi membius tikus agar pingsan sebelum dibedah. Larutan sukrosa EDTA penting untuk menjaga agal sel tidak rusak. EDTA yang telah mengelat logam dapat mempermudah lisisnya sel. Larutan sukrosa-EDTA berfungsi sebagai desinfektan atau penghilang kuman. Larutan sukrosa-CaCl2 berfungsi sebagai pelarut dan merupakan larutan isotonis yang berguna untuk menjaga tekanan di luar dan tekanan di dalam sel tetap sama. Kedua larutan tersebut digunakan dalam keadaan dingin agar organel yang diisolasi agar tidak rusak dan tetap utuh strukturnya. Suhu dibuat rendah untuk meminimalisir degradasi enzim- enzim yang ada dalam komponen sel (Safitri & Artika 2009).
Bobot hati tikus yang diperoleh sebesar 6.60 gram, namun hanya 5.50 gram yang dibunakan dalam pembuatan homogenat. Homogenat hati tikus disentirifugasi pada 700 g selama 10 menit. Bagian pellet akan diresuspensi dan disentrifugasi untuk mendapatkan fraksi inti. Isolasi fraksi inti menggunakan sentrifugasi pada 1500 g selama 10 menit dan diperoleh bobot pellet fraksi inti sebesar 1.37 gram dan %rendemen sebesar 24.91%. dari perhitungan matematis diperoleh nilai RPM untuk preparasi homogenate sebesar 2,405.6261 rpm dan pada isolasi fraksi inti sebesar 3,521.4761 rpm.

Simpulan
Fraksinasi merupakan metode pemisahan dengan menggunakan proses sentrifugasi. Hewan percobaan yang digunakan ialah tikus jantan dari galur Sprague Dawley. Hasil praktikum ini diperoleh hati dengan bobot 5.50 gram, inti 1.37 gram dengan rendemen 24.91%.

Daftar Pustaka
Boyer Rodney. 2000. Modern Instrumental of Biochemistry Third Edition. SanFrancisco: Addision Wesley Longman.
Campbell et al. 2000. Biologi Jilid Kesatu Edisi Kelima. Jakarta: Erlangga.
Hendra A. 1989. Teknik Pemisahan dalam Analisis Biologis. Bogor: IPB Press.
Kohn DF dan SW Bartold. 1984. Biology and Disease of Rat Laboratory Animal. New York: Academic Press Inc.
Koolman jan, Rohm KH. 1994. Color Atlas of Boichemistry. Germany: Georg thieme verlag.
Safitri Mega, Artika I Made. 2009. Diktat Kuliah Struktur dan Fungsi Subselluler. Bogor: Departemen Biokimia FMIPA IPB.
Sloane Ethel. 2003. Anatomi dan Fisiologi untuk Pemula. Palupi Widyawati, penerjemah. Jakarta: EGC. Terjemahan dari: Anatomy and Physiology: aneasy learner.
Yuwono, Tribowo. 2008. Biologi Molekuler. Jakarta : Erlangga.



Laporan SFS Protein Metode Bradford
Thursday May 16th 2013, 5:57 am
Filed under: Uncategorized

Laporan Praktikum Hari/Tanggal : Senin / 04 Maret 2013
Struktur dan Fungsi Subseluler Waktu : 08.00 – 11.00 WIB
PJP : Syaefuddin, M.Si Asisten : Nabila Ayuningtyas
Risky Wulansari
Tuhfah Amaliah
Mina Erfani SL

PENENTUAN PROTEIN
METODE BRADFORD

Kelompok 02

Ayu Syafitri S G84110002
Rani Nur Fitriani G84110001
Yuyun Hikmatul U G84110088

DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013

Pendahuluan
Dalam melaksanakan berbagai kegiatan sehari-hari, manusia membutuhkan asupan energi. Energi ini diperoleh dari bahan makanan yang mengandung berbagai macam jenis nutrisi, salah satunya adalah protein. Protein merupakan suatu senyawa makro-molekul yang terdiri atas sejumlah asam amino yang dihubungkan dengan ikatan peptida. Jika ikatan peptida tersebut terjadi dari dua asam amino hasilnya disebut sebagai dipeptida dan jika dari tiga, empat, atau lima peptida hasilnya dikatakan sebagai tripeptida, peptapeptida dan penta peptida. Jika ikatan peptida tersebut lebih dari dua ikatan maka secara umum dapat dinamakan sebagai polipeptida (Koolman 2005).
Protein juga merupakan makromolekul yang paling berlimpah di dalam sel dan menyusun lebih dari setengah berat kering pada hampir semua organisme. Protein merupakan instrumen yang mengekspresikan informasi genetik. Protein mempunyai fungsi unik bagi tubuh, antara lain menyediakan bahan-bahan yang penting peranannya untuk pertumbuhan dan memelihara jaringan tubuh, mengatur kelangsungan proses di dalam tubuh, dan memberi tenaga jika keperluannya tidak dapat dipenuhi oleh karbohidrat dan lemak. Protein ada yang reaktif karena asam amino penyusunnya mengandung gugus fungsi yang reaktif, seperti SH, -OH, NH2, dan –COOH. Contoh protein aktif adalah enzim, hormon, antibodi, dan protein transport (Fessenden 1986).
Penentuan konsentrasi protein digunakan secara luas dalam analisis produk seperti produk industri, pertanian, dan bioteknologi. Protein dalam sampel hayati dapat dikenali dengan beberapa macam reaksi, antara lain: uji biuret, uji xantoprotet, uji belerang, dan metode Bradford. Uji biuret digunakan untuk mengetahui adanya ikatan peptida dalam protein yang akan membentuk kompleks berwarna ungu jika terdapat kandungan protein dalam sampel. Uji xantoproteat digunakan untuk mengidentifikasi gugus fenil (cincin benzena) dalam protein yang ditandai dengan terbentuknya warna kuning pada pemanasan HNO3 pekat. Adanya belerang dalam protein dapat diidentifikasi dengan terbetuknya endapan hitam dari PbS setelah ditambahkan reagen.
Kadar protein dalam sampel hayati dapat pula ditentukan dengan metode spektrofotometri, baik menggunakan sinar uv maupun dengan sinar tampak setelah penambahan pereaksi pewarna yang intensitas warna yang dibentuknya sebanding dengan kadar protein. Salah satu pewarnaan yang praktis dan sensitif adalah metode Bradford dibandingkan cara lainnya seperti metode Biuret atau Lowry. Larutan yang mengandung 5-100 mg protein dapat ditentukan dengan metode lowry. Warna yang timbul, disebabkan oleh reduksi fosfomolibdat-fosfowolframat oleh tirosin yang ada dalam protein.
Metode Bradford adalah salah satu metode dalam penentuan kadar protein suatu bahan. Prinsip kerja dari metode ini didasarkan pada pengikatan secara langsung reagen Bradford oleh protein yang mengandung residu asam amino dengan rantai samping aromatik. Metode Bradford memerlukan pereaksi NaCl dan Bovine Serum Albumine (BSA). Masing-masing pereaksi memiliki spesifikasi fungsi dalam menetukan kadar protein bahan. NaCl adalah sejenis garam yang berfungsi untuk membantu pengikatan reagen Bradford oleh protein sedangkan BSA merupakan larutan standar yang mengandung protein (Hawab 2004).

Tujuan
Praktikum ini bertujuan menentukan kadar protein dalam suatu sampel dengan metode spektrofotometri menggunakan kurva standar.

Alat dan Bahan
Alat yang digunakan pada praktikum penentuan protein dengan metode Bradford adalah spektrofotometer, tabung reaksi, pipet volumetrik, balp, dan kuvet.
Bahan yang digunakan dalam praktikum penentuan protein, yaitu: larutan HCl, laruran Bovine Serum Albumine (BSA), reagen Bradford, aquades, dan kertas tissue.

Prosedur percobaan
Sebelum melakukan pengukuran dengan spektrofotometer, siapkan 6 laruten standar BSA pada 6 tabung reaksi yang berbeda dengan volume 0.000, 0.025, 0.035, 0.040, 0.045, dan 0.050 dalam satuan µl. Larutan ini kemudian ditambahkan dengan larutan HCl sampai volume total campuran mencapai 0.050 µl. Zat warna reagen Bradford dimasukkan sebanyak 2.5 ml pada 6 tabung reaksi yang berbeda. Tabung pertama yang berisi 0.050 larutan HCl merupakan blanko.
Reagen Bradford dicampurkan ke dalam sampel 5 menit sebelum pengukuran dengan spektrofotometer dilakukan. Spektrofotometer digunakan untuk mengukur nilai absorbans dari sampel dalam 6 konsentrasi berbeda yang dinyatakan dalam fungsi panjang gelombang. Pada setiap tabung, dilakukan pembacaan absorban pada panjang gelombang 595 nm. Selanjutnya dibuatlah kurva standar antara nilai absorban terhadap konsentrasi protein (BSA) untuk memperoleh persamaan garis.
Pada penentuan konsentarsi protein (BSA), ke dalam 2 tabung reaksi yang bersih dimasukkan 100 µl larutan BSA yang kemudian ditambahkan reagen Bradford sebanyak 5 ml. Selanjutnya dilakukan pembacaan absorban pada panjang gelombang 595 nm. Konsentrasi protein diperoleh dengan memasukkan nilai absorban pada persamaan garis dari kurva standar.

Hasil Percobaan
Tabel 1 Penentuan kurva standar
Tabung ke- [BSA] ( )
Absorbansi
1 0.000 0.000
2 0.100 0.531
3 0.200 0.538
4 0.300 0.580
5 0.500 0.593
6 1.000 0.613

Contoh Perhitungan:
Untuk tabung 2
- V1 (BSA) = 5 μL = 0.005 mL
- V NaCl = 45 μL = 0.045 mL
- M (BSA) = 1

- V2 = V BSA + V NaCl
= 0.005 mL + 0.0045 mL
= 0.050 mL
- V1 x M1 = V2 x M2
0.005 mL x 1 = 0.050 mL x M2
M2 =
M2 = 0.100
Jadi konsentrasi larutan BSA untuk tabung 2 sebesar 0.100
Gambar 1 Kurva hubungan antara absorbansi dan konsentrasi larutan
Tabel 2 Pengukuran sampel
Sampel Absorbansi (A) [Sampel] ( )

1 0.571 0.607
2 0.549 0.548

Contoh Perhitungan:
y = 0.374x + 0.344
Untuk y (A) = 0.571, maka :
y = 0.374x + 0.344
0.571 = 0.374x + 0.344
0.571 – 0.344 = 0.374x
0.227 = 0.374x
x = 0.607
Jadi, konsentrasi sampel pada absorbansi 0.571 ialah 0.607

Rata-rata konsentrasi =
= 0.5775

Pembahasan
Percobaan yang dilakukan pada praktikum ini yaitu mengukur nilai absorbansi dari sampel dalam 6 konsentrasi berbeda yang dinyatakan dalam fungsi panjang gelombang. Sampel yang digunakan berupa larutan BSA yang dibagi dalam 6 tabung reaksi dengan volume berbeda. Volume tabung pertama sampai dengan tabung keenam berturut-turut adalah 0.000, 0.025, 0.035, 0.040, 0.045, dan 0.050 dalam satuan µl. Tabung pertama merupakan blanko. Pengukuran nilai absorbansi dilakukan dengan menggunakan alat spektrofotometer.
Terdapat beberapa cara atau metode dalam penentuan konsentrasi protein. Cara yang paling sering digunakan adalah dengan prinsip kolorimetri (spektrofotometri) dan penggunaan absorbansi pada panjang gelombang UV (ultraviolet). Penentuan konsentrasi protein dalam suatu sampel dapat dilakukan dengan metode spektrofotometri dengan mengikuti hukum Lambert-Beer.
Penentuan kadar protein dengan metode Bradford merupakan salah satu contoh metode spektrofotometri dalam penentuan kadar protein. Metode Bradford menekankan bahwa absorbsi spektrum dilakukan dalam dua bentuk pengujian secara bersamaan. Hal ini menyebabkan respon yang tidak linear pada kurva standar. Banyak pengguna metode Bradford dan peneliti menganggap bahwa respon yang dihasilkan adalah linear. Meskipun demikian, saat kurva standar digambarkan akan lebih mirip dengan kurva linier. Metode ini hanya akan linier jika konsentrasi larutan standar maupun sampel yang digunakan kecil (Rosenberg 2004).
Metode lain yang sering digunakan adalah metode biuret dan metode Lowry. Metode Biuret merupakan metode kuantifikasi protein yang tertua. Metode ini masih banyak digunakan karena mudah dilakukan, reagen yang mudah disiapkan, dan pengaruh gangguan senyawa lain yang minim. Prinsip metode ini adalah proses kelat pada ion kupri oleh polipeptida pada kondisi alkali.
Metode Lowry merupakan pengembangan dari metode Biuret. Dalam metode ini terlibat 2 reaksi. Awalnya, kompleks Cu(II)-protein akan terbentuk sebagaimana metode biuret, yang dalam suasana alkalis Cu(II) akan tereduksi menjadi Cu(I). Ion Cu+ kemudian akan mereduksi reagen Folin-Ciocalteu, kompleks phosphomolibdat-phosphotungstat (phosphomolybdotungstate), menghasilkan heteropolymolybdenum blue akibat reaksi oksidasi gugus aromatik (rantai samping asam amino) terkatalis Cu, yang memberikan warna biru intensif yang dapat dideteksi secara kolorimetri. Kekuatan warna biru terutama bergantung pada kandungan residu tryptophan dan tyrosine-nya. Keuntungan metode Lowry adalah lebih sensitif (100 kali) daripada metode Biuret sehingga memerlukan sampel protein yang lebih sedikit. Batas deteksinya berkisar pada konsentrasi 0.01 mg/mL. Namun metode Lowry lebih banyak interferensinya akibat kesensitifannya (Lovrien 1998).
Metode Bradford sensitif untuk menentukan kadar protein albumin atau protein globular lainnya. Metode Bradford juga merespon adanya senawa-senyawa yang mengganggu dalam pengukuran yang nantinya dapat membiaskan hasil pengukuran. Namun akibat kemudahan dan sensitivitas yang dimilikinya dalam penentuan kadar protein, metode ini menjadi popular dan banyak digunakan (Lovrien 1998).
Pada penentuan protein dengan metode Bradford, digunakan pereaksi berupa larutan NaCl dan laruran Bovine Serum Albumine (BSA). Masing-masing pereaksi memiliki spesifikasi fungsi dalam menetukan kadar protein bahan. NaCl adalah sejenis garam yang berfungsi untuk membantu pengikatan reagen Bradford oleh protein. Laruran Bovine Serum Albumine (BSA) merupakan larutan standar yang mengandung protein (Hawab 2004).
Pemilihan standard protein merupakan penentu keberhasilan analisis kuantitatif. Bovine Serum Albumin (BSA) adalah protein yang umum digunakan sebagai standard dalam penetapan kadar protein. BSA banyak dipilih karena tingkat kemurniannya yang tinggi dan harganya relatif murah (Lovrien 1998). Standard protein lain yang bisa digunakan adalah Bovine Gamma Globulin (BCG), terutama untuk keperluan kuantifikasi antibodi karena BCG menghasilkan warna yang sangat mirip dengan immunoglobulin G (IgG).
Reagen Bradford berisi pewarna biru komasi, etanol 95%, dan phosphoric acid 85%. Gugus trifenilmetana pada reagen berikatan dengan gugus nonpolar pada protein, sedangkan gugus anion sulfonat berinteraksi dengan rantai samping protein yang bersifat kationik (seperti arginin dan lisin) pada suasana asam. Terjadi perubahan warna ketika terjadi reaksi antara reagen dengan protein. Perubahan warna tersebut digunakan untuk menentukan kadar protein dalam sampel.
Pembuatan kurva standar bertujuan untuk mengetahui hubungan antara konsentrasi larutan dengan nilai absorbansinya sehingga konsentrasi sampel dapat diketahui. Terdapat dua metode untuk membuat kurva standar yakni dengan metode grafik dan metode least square (Underwood 1990).
Pada percobaan pembuatan kurva standar diperoleh data konsentrasi masing-masing tabung. Nilai absorban dan konsentrasi tabung pertama sebagai blanko sampai dengan tabung keenam berturut-turut adalah 0.000, 0.000 mg/ml; 0.531, 0.100 mg/ml; 0.538, 0.200 mg/ml; 0.580, 0.300 mg/ml; 0.593, 0.700 mg/ml; dan 0.613, 1.000 mg/ml. Grafik yang diperoleh menunjukkan kurva standar yang baik dengan persamaan linier y = 0.374x + 0.3449 dan R2 = 0.331.
Pada penentuan kadar protein dalam sampel diperoleh nilai absorbansi sampel pertama 0.571 dengan konsentrasi sebesar 0.607. Sampel kedua dengan nilai absorbansi 0.549 memiliki konsentrasi sebesar 0.548. Nilai konsentrasi sampel yang diperoleh berbanding lurus dengan nilai absorbannya, sehingga semakin besar nilai absorban maka diperoleh nilai konsentrasi yang semakin besar pula.

Simpulan
Hasil percobaan pembuatan kurva standar diperoleh persamaan linier y = 0.374x + 0.3449 dengan R2 = 0.331. Pada penentuan kadar protein dalam sampel diperoleh nilai absorbansi sampel pertama dan kedua berturut-turut sebesar 0.571 dengan konsentrasi sebesar 0.607 dan 0.549 dengan konsentrasi sebesar 0.548. Nilai konsentrasi sampel yang diperoleh berbanding lurus dengan nilai absorbannya.

Daftar Pustaka
Fessenden. 1986. Kimia Organik Jilid 2. Jakarta: Erlangga.
Hawab, HM. 2004. Pengantar Biokimia. Jakarta: Bayu Media Publishing.
Koolman J. 2005. Color Atlas of Atlas of Biochemistry. New York: Thieme.
Lovrien R, Matulis D. 1998. Current Protocols in Protein Science. New York: Wiley.
Rosenberg, I.M. 2004. Protein Analysis and Purification: Benchtop techniques. Massachusetts General Hospital: Boston.
Underwood AL. 1990. Analisis Kimia Kiantitatif Edisi keenam. Jakarta: Erlangga.



Laporan SFS Spektrofotometer
Thursday May 16th 2013, 5:51 am
Filed under: Uncategorized

Laporan Praktikum Hari/Tanggal : Senin / 25 Februari 2013
Struktur dan Fungsi Subseluler Waktu : 08.00 – 11.00 WIB
PJP : Syaefuddin, M.Si
Asisten : Suhermanto
Risky Wulansari
Tuhfah Amaliah
Azra Zahrah NI

PENDAHULUAN
(PENGGUNAAN SPEKTROFOTOMETER)

Kelompok 03

Ayu Syafitri S G84110002
Rani Nur Fitriani G84110001
Yuyun Hikmatul U G84110088

DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013

Pendahuluan
Beer dan lambert menemukan hukum yang menerangkan interaksi bahan kimia dengan gelombang cahaya (elektromagnetik), yang disimpulkan dalam hukum Beer-Lambert menyebabkan berkembangnya analisis kimia dengan menggunakan alat instrumentasi yakni spektrofotometer (Tipler 1991). Spektrofotometer merupakan alat yang digunakan untuk mengukur absorbansi dengan cara melewatkan cahaya dengan panjang gelombang tertentu pada suatu obyek kaca atau kuarsa yang disebut kuvet. Sebagian dari cahaya tersebut akan diserap dan sisanya akan dilewatkan. Nilai absorbansi dari cahaya yang dilewatkan akan sebanding dengan konsentrasi larutan di dalam kuvet (Cairns 2009).
Pada umumnya, spektrofotometer terdiri dari unsur-unsur seperti sumber cahaya, monokromator, sel, fotosel, dan detektor. Sumber radiasi spektrofotometer dapat digunakan lampu deuterium untuk radiasi di daerah sinar ultraviolet (UV) sampai 350 nm, atau lampu filamen untuk sinar tampak sampai inframerah. Sinar yang dikeluarkan sumber radiasi merupakan sinar polikromatis, sehingga harus dibuat menjadi sinar monokromatis oleh monokromator. Radiasi yang melewati monokromator diteruskan ke zat yang akan diukur dan sebagian radiasinya akan diserap oleh zat tersebut. Zat yang akan diukur nilai absorbannya diletakkan pada sel dengan wadah kuvet. Sinar yang diteruskan akan mencapai fotosel dan energi sinar diubah menjadi energi listrik (Khopkar 2003).
Metode analisa menggunakan spektrofotometer disebut spektrofotometri. Spektrofotometri merupakan suatu metoda analisa yang didasarkan pada pengukuran serapan sinar monokromatis oleh suatu lajur larutan berwarna pada panjang gelombamg spesifik dengan menggunakan monokromator prisma atau kisi difraksi dengan detektor fototube. Benda bercahaya seperti matahari atau bohlam listrik memancarkan spektrum yang lebar terdiri atas panjang gelombang. Panjang gelombang yang dikaitkan dengan cahaya tampak itu mampu mempengaruhi selaput pelangi mata manusia dan karenanya menimbulkan kesan subyektif akan ketampakan (vision). Dalam analisis secara spektrofotometri terdapat tiga daerah panjang gelombang elektromagnetik yang digunakan, yaitu daerah UV (200 – 380 nm), daerah visible (380 – 700 nm), daerah inframerah (700 – 3000 nm) (Khopkar 2003).
Larutan yang akan digunakan dalam penggunaan spektrofotometer adalah larutan blanko. Larutan blanko merupakan larutan yang tidak mengandung analat untuk dianalisis (Basset 1994). Larutan blanko digunakan sebagai kontrol dalam suatu percobaan sebagai nilai 100% transmittans. Kurva standar merupakan standar dari sampel tertentu yang dapat digunakan sebagai pedoman ataupun acuan untuk sampel tersebut pada percobaan. Pembuatan kurva standar bertujuan untuk mengetahui hubungan antara konsentrasi larutan dengan nilai absorbansinya sehingga konsentrasi sampel dapat diketahui. Terdapat dua metode untuk membuat kurva standar yakni dengan metode grafik dan metode least square (Underwood 1990).

Tujuan
Praktikum ini bertujuan memahami penggunaan spektrofotometer serta dapat membuat kurva standar untuk analisis kuantitatif.

Alat dan Bahan
Alat yang digunakan pada praktikum pengenalan alat-alat laboratorium mengenai penggunaan alat spektrofotometer adalah spektrofotometer, tabung reaksi, gelas piala 100 ml, pipet volumetrik, balp, dan kuvet.
Bahan yang digunakan dalam penggunaan alat spektrofotometer, yaitu: metilen biru, aquades, dan kertas tissue.

Prosedur percobaan
Sebelum melakukan pengukuran dengan spektrofotometer, siapkan 5 laruten metilen biru pada 5 tabung reaksi yang berbeda. Volume metilen biru pada tabung pertama sampai dengan tabung kelima berturut-turut 1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml, dan 5 ml. Kemudian setiap tabung diencerkan dengan penambahan aquades sampai volume setiap larutan mencapai 5 ml, sehingga diperoleh larutan metilen biru dengan konsentrasi 2×10-5, 4×10-5, 6×10-5, 8×10-5, dan 1×10-4. Tabung ketiga merupakan tabung kontrol. Spektrofotometer digunakan untuk mengukur nilai transmitans atau absorbans dari larutan metilen biru dalam lima konsentrasi berbeda yang dinyatakan dalam fungsi panjang gelombang.
Pada penggunaannya, spektrofotometer harus dinyalakan 15 menit sebelum digunakan untuk pemanasan dengan menekan tombol POWER/ZERO. Setelah 15 menit, panjang gelombang dipilih dengan tombol WAVELENGTH. Kuvet diisi dengan aquades untuk menyesuaikan meter menjadi nol (zero), selanjutnya dilakukan pengukuran terhadap sampel. Larutan sampel dimasukkan ke dalam kuvet dan diletakkan ke dalam sel. Panjang gelombang disesuaikan dan nilai transmitans dapat dibaca pada meter. Pada pengukuran larutan kontrol digunakan panjang gelombang antara 600-680 nanometer (nm), namun pada pengukuran keempat larutan lainnya hanya menggunakan panjang gelombang 660 nm (merupakan panjang gelombang yang menghasilkan nilai transmitans tertinggi pada larutan kontrol).

Hasil Percobaan
Tabel 1 Penentuan panjang gelombang maksimal
Panjang gelombang (nm) Absorbansi
600 2.187
610 2.356
620 2.342
630 2.361
640
650
660
670
680 2.570
2.778
2.801
2.365
1.384

Gambar 1. Kurva hubungan antara panjang gelombang dan absorbansi

Tabel 2 Pembuatan kurva standar
Konsentrasi Metilen Biru (M) Absorbansi
2×10-5 0.857
4×10-5 1.776
6×10-5 2.169
8×10-5 2.794
1×10-4 3.000

Gambar 2. Kurva hubungan antara konsentrasi biru metilen dan absorbansi

Tabel 3 Pengukuran sampel
Absorbansi Konsentrasi Metilen Biru (M)
1.282 63.600
1.280 63.500
1.361 67.550

Y = absorbansi
Y = a+bx
Contoh perhitungan:
Y = a+bx
1.282 = 0.01+0.02x
x = (1.282-0.01)/0.02
x = 63.60

Pembahasan
Percobaan yang dilakukan pada praktikum ini, yaitu mengukur nilai absorbansi dari larutan metilen biru dalam lima konsentrasi berbeda yang dinyatakan dalam fungsi panjang gelombang. Sampel yang digunakan berupa larutan metilen biru yang dibagi dalam lima tabung reaksi dengan konsentrasi yang berbeda. Konsentrasi tabung pertama sampai dengan tabung kelima berturut-turut adalah 2×10-5, 4×10-5, 6×10-5, 8×10-5, dan 1×10-4. Tabung ketiga merupakan tabung kontrol. Pengukuran nilai absorbansi dilakukan dengan menggunakan alat spektrofotometer.
Spektrofotometer bekerja dengan menghasilkan cahaya (monokromatik maupun campuran) yang akan diarahkan pada suatu medium homogen sehingga sebagian dari sinar yang dihasilkan akan masuk dan dipantulkan, sebagian lagi akan diserap dalam medium itu, dan sisanya akan diteruskan. Nilai yang keluar dari cahaya yang diteruskan dinyatakan dalam nilai absorbansi karena memiliki hubungan dengan konsentrasi sampel. Dalam penggunaannya, spektrofotometer harus dikalibrasi terlebih dahulu sebelum digunakan untuk mengatasi kesalahan pemakaian. Menurut Tahir (2005), dengan adanya proses kalibrasi pada spektrofotometer akan membantu untuk memperoleh hasil yang akurat dan presisi.
Berdasar pada sumber cahaya yang digunakan, spektrofotometer terbagi atas Spektrofotometer Vis (Visible), Spektrofotometer UV (Ultra Violet), Spektrofotometer UV-Vis, dan Spektrofotometer IR (Infra Red). Spektrofotometer Vis (Visible) menggunakan cahaya tampak sebagai sumber cahayanya dan hanya dapat menganalisa sampel yang memiliki warna. Spektrofotometer UV (Ultra Violet) menggunakan sinar UV sebagai sumber cahayanya yang memungkinkan instrumen mengamati sampel walaupun tidak memiliki warna. Namun, banyak kemungkinan terjadinya interferensi dari senyawa lain selain analat yang juga menyerap pada panjang gelombang UV yang berpotensi menimbulkan bias pada hasil analisa. Spektrofotometer UV-Vis hampir sama dengan spektrofotometer UV, namun spektrofotometer jenis ini menggunakan dua sumber cahaya. Spektrofotometer IR (Infra Red) didasarkan pada penyerapan panjang gelombang infra merah yang hanya dapat mendeteksi sampel dalam keadaan murni.
Sampel yang digunakan dalam percobaan ini adalah metilen biru. Dalam bidang Biokimia, larutan ini berperan dalam proses pewarnaan sehingga mempermudah dan memperjelas ketika akan mengamati bagian dari suatu sel. Percobaan pertama dilakukan dengan menentukan panjang gelombang maksimum dari larutan kontrol (metilen biru dengan konsentrasi 6×10-5). Penentuan panjang gelombang maksimum dilakukan untuk mengetahui ketika absorpsi mencapai maksimum sehingga meningkatkan proses absorpsi larutan terhadap sinar (Rohman 2007). Panjang gelombang maksimum yang diperoleh dari percobaan adalah 660 nm dengan nilai absorbansi 2.801. Hal ini sesuai dengan Cahyanto (2008) bahwa larutan metilen biru memiliki panjang gelombang maksimum sebesar 660 nm.
Hasil yang diperoleh dari penentuan panjang gelombang maksimum kemudian dijadikan patokan pada pengukuran absorbansi larutan metilen biru selanjutnya. Nilai absorbansi larutan metilen biru dengan konsentrasi 2×10-5, 4×10-5, 6×10-5, 8×10-5, dan 1×10-4 berturut-turut adalah 0.857, 1.776, 2.169, 2.794, dan 3.000. Nilai absorbansi berbanding lurus dengan besarnya konsentrasi suatu larutan. Nilai absorbansi dari lima konsentrasi biru metilen yang berbeda selanjutnya dibuat kurva standar dengan menghitung persamaan garis antara konsentrasi dengan absorbansinya. Pembuatan kurva standar bertujuan untuk mengetahui hubungan antara konsentrasi larutan dengan nilai absorbansinya sehingga konsentrasi sampel dapat diketahui. Terdapat dua metode untuk membuat kurva standar yakni dengan metode grafik dan metode least square (Underwood 1990). Berdasarkan grafik yang menunjukkan hubungan antara konsentrasi dengan absorbansi diperoleh kurva standar dengan persamaan y = 0.01 + 0.02x.

Simpulan
Penentuan nilai absorbansi biru metilen dilakukan dengan menggunakan instrumen spektrofotometer. Panjang gelombang yang digunakan adalah panjang gelombang maksimum, yaitu 660 nm. Hasil absorbansi biru metilen digunakan sebagai kurva standar yang menghubungkan konsentrasi dan absorbansinya. Selanjutnya kurva standar digunakan untuk menghitung konsentrasi sampel yang belum diketahui. Praktikan mampu menggunakan alat spektrofotometer, membuat kurva standar dan menghitung konsentrasi sampel.

Daftar Pustaka
Basset, J. 1994. Kimia Analisis Kuantitatif Anorganik. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC.
Beran, JA. 1996. Chemistry in The Laboratory. John Willey & Sons.
Cahyanto. 2008. Tinjauan Spektrofotometer. Xains Info. [terhubung berkala].
Cairns D. 2009. Intisari Kimia Farmasi Edisi Kedua. Puspita Rini, penerjemah. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC. Terjemahan dari: Essentials of Pharmaceutical Chemistry Second Edition.
Khophar SM. 2003. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta: UI Press.
Tipler P. 1991. Fisika untuk Sains dan Teknik Jilid . Bandung: Erlangga.
Rohman. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta: Pustaka Pelajar.
Tahir I. 2005. Arti Penting Proses Kalibrasi Dalam Proses Pengukuran Analitik: Aplikasi Pada Penggunaan pH Meter dan Spektrofotometer Uv-Vis. Yogyakarta: FMIPA UGM.
Underwood AL. 1990. Analisis Kimia Kiantitatif Edisi ke Enam. Jakarta: Erlangga.



Pelatihan penulisan karya ilmiah
Friday September 30th 2011, 9:06 am
Filed under: Uncategorized

jiiiaaaah..

hayoo sumangaa’(:

aseeek



Hello world!
Friday September 30th 2011, 8:54 am
Filed under: Uncategorized

Selamat datang di Blog Mahasiswa IPB. Ini adalah postingan pertamamu. Edit atau hapus postingan ini dan mulailah menulis blog sekarang juga!